左旋肉碱体外培养中提高睾丸精子活率的实验研究

王怀秀， 李先莲， 袁彩霞， 宋玉梅， 曹莹丽， 董丽娜， 秦琴

(山西省人民医院生殖医学科，太原030012 )

自1978年第一例试管婴儿出生以来，不育症，尤其是排卵障碍与卵子输送障碍所致不育症的治疗获得突破。自1992年卵子胞浆内单精子显微注射(ICSI)技术问世以来，即使精液中无精子的患者也有望利用睾丸、附睾中的精子进行ICSI获得生育。但是，睾丸中的精子不能运动，难以判断其是否为活精子，需要体外培养一段时间部分活精子才能获得一定运动能力。为了提高睾丸精子的活率，便于选择用于ICSI的精子，本文尝试对睾丸精子用含左旋肉碱培养液进行培养，并对其提高精子活力的效果进行评价。

材料与方法

一、材料

1.试剂： 左旋肉碱和矿物油(Sigma，美国)。ART1020受精培养液及含Hepes缓冲剂的培养基ART1023(Sage，美国)。

2.标本来源： 从2011年5月至201年10月，对10例无精子症不育症患者进行睾丸活检，对送活检剩余睾丸组织在不同浓度乙酰肉碱培养液中进行体外培养，观察不同浓度乙酰肉碱对睾丸精子活力的影响。10例患者睾丸体积13~15ml，生殖器官发育及卵泡刺激素、黄体生成素、雌激素、孕激素、催乳素及睾酮测定正常。其中1例输精管触诊未及输精管，超声检查未及精囊，结合精液检查精液量少、pH偏低以及中性α糖苷酶低于正常诊断为输精管、精囊缺如。另9例体检附睾可及硬结，中性α糖苷酶低于正常，诊断为梗阻性无精子症。该课题经过医院伦理委员会审查通过。

方法

1.左旋肉碱液配制：用ART1020液溶解左旋肉碱，配制成含左旋肉碱0mg/ml,0.1mg/ml,1mg/ml，10mg/ml，15mg/ml的培养液，0.22μm针头过滤器过滤备用。

2.睾丸活检：常规消毒术野后，铺无菌孔巾，用2%利多卡因在与睾丸中部相应阴囊处进行局部浸润麻醉。切开阴囊皮肤后，钝性分离组织至睾丸白膜。切开白膜，将挤出切口的生精小管切下，部分送组织学检查，部分进行左旋肉碱试验。取活检后，常规缝合白膜、阴囊皮下组织以及阴囊皮肤。用创可贴贴敷伤口。

3.左旋肉碱试验： 将取得的睾丸组织浸泡于经过平衡的ART1023培养液中，用注射器针头撕扯曲细精管并换液2次清洗，去除组织中的血细胞。用注射器针头将曲细精管撕碎，2000r/min离心10min，去上清，将细胞团用0.3mlART1023液体混匀。在经32。C,5%CO2平衡1d，含左旋肉碱0mg/ml,0.1mg/ml,1mg/ml，10mg/ml，15mg/ml的ART1020液滴(每液滴1.0ml)中分别加入0.1ml细胞悬液。置培养箱内(32。C,5%CO2)培养4h，然后在显微镜下观察精子活动情况。每个液滴计数100条精子，并计算出活动精子及非活动精子比例。

三、统计学分析

应用SPSS11.5 统计学软件包对数据进行分析处理, 因5组资料方差不齐，采用Kruskal-Wallis Test进行多样本比较，并用Mann-Whitney Test进行两样本比较。P