王怀秀[1] 李弘 王毅民 秦琴 董丽娜

摘要 目的 研究“精之助胶囊”对小白鼠生殖功能及睾丸、附睾超微结构的影响。方法 对造模后实验组小白鼠灌喂“精之助胶囊”，在一般情况、产仔数量、精液质量、睾丸附睾组织学及超微结构变化等方面与对照组进行对比研究，并对小白鼠进行急性毒性试验。结果 “精之助胶囊”可显著改善实验组小白鼠的一般情况，增加产仔数，逆转小白鼠睾丸、附睾超微结构病理变化。急性毒性试验证明该中药制剂无毒性。结论 “精之助胶囊”可安全有效地提高造模后小白鼠的生育能力。

关键词：少精子症 弱精子症 中药 男性不育 小白鼠

The effect of "jingzhizhu capsule" on fertility of male mice

Wang Huaixiu Li Hong Wang Yimin，Qin Qin, Dong Lina

(Shanxi Provincial Hospital , Taiyuan ,030012)

Abstract -ive To study the effect of "Jingzhizhu capsule "on fertility of male mice and the ultrastructure of testis and epididymis . Methods The general condition, fecundity, the histology and ultrastructure of testis and epididymis of experimental group were compared with those of control group. In addition , acute toxicity test was also conducted in mice. Results "Jingzhizhu capsule" can significantly improve the general condition, enhance the fecundity ,reverse the pathological change of testis and epididymis of mice. Acute toxicity test found no toxicity. Conclusions “Jingzhizhu capsule" can effectively improve the male fertility of mice with safety.

Key words: Oligospermia; asthenospermia; traditional Chinese medicine; male infertility, mice

近年来，男性的精液质量呈明显下降趋势，男性不育的发病率有逐年增高的趋向(1)。虽然人工授精和体外受精等辅助生殖技术的问世使得许多少精子症、弱精子症的患者获得了生育的希望，但接受以上辅助生殖技术不仅费用昂贵，而且耗费时间。许多学者尝试用克罗米芬等西药改善精液质量，但效果不确切。中医药成分复杂，可以对人体进行多靶点调节，对许多西方医学束手无策的疾病显示出了独特的优势。因此，我们根据中医理论拟定了处方，对精液质量低下的男性不育患者进行尝试。经过长期的临床实践，我们摸索出了可以明显改善不育男性精液质量的中药协定处方，该处方不仅可以提高不育患者精子密度、精子活率以及精子前向运动，还能改善患者的精神状态以及性功能。为了了解该中药协定处方的作用机理及是否具有毒性，我们将该处方中药材制备为胶囊制剂，对小白鼠进行了动物试验。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品及培养液

试验所用药材主要有党参、黄芪、白术、熟地、当归、菟丝子及五味子等，具有补气、益肾功能。将药材共煎2次，每次2h。将提取液经纱布过滤。过滤液经低压浓缩，成浸膏状时入恒温干燥箱中进行低温干燥(60.C)。将干燥提取物粉碎，过筛(80#)，装0号胶囊(装量0.5g)。 试验所用培养液 ART1020培养液购自美国Sage公司。

1.1.2动物

从山西省中医药研究院实验动物基地购买8周龄雄性和雌性昆明系小白鼠(体重25-30g)各53只，用于药效学研究;60只体重为18-22g昆明系小白鼠，雌雄各半，用于急性毒性试验。

1.2试验方法

1.2.1 对小白鼠生育功能的观察 将雄性小白鼠随机分为空白组(7只)，造模组(8只)，试验组(38只)共三组。将造模组和实验组小白鼠用5%水合氯醛按照400mg/kg剂量腹腔注射进行麻醉。用丝线将麻醉小鼠前肢固定在支架上，使阴囊浸泡在43℃温水中20分钟造模(2)。造模次日，开始给试验组雄性小白鼠灌喂“精之助胶囊”溶液。每只小鼠灌喂0.2ml(相当于50mg胶囊制剂)，持续15天。灌喂结束次日，将雌性小白鼠随机分配到雄鼠笼中与雄鼠1:1合笼，并记录每笼小白鼠产仔日期、产仔数。小白鼠的动情周期为3天，考虑到合笼时不一定每只雌性小白鼠均处于动情周期的适宜受孕期，为了避免由于合笼时间不适宜造成不孕，将雌雄小白鼠合笼饲养7d。由于小白鼠妊娠时间为22d，观察产仔数截止时间为合笼后30d。

1.2.2精液检查：由于小白鼠的精子生成周期大约为35天，在给药结束后37天，无菌条件下从附睾尾部采取精液，置0.5ml ART1020培养液中在5% CO2，37℃培养箱孵育。30min后，在倒置显微镜下观察精子分散情况，用血球计数板计数精子密度及活动情况。

1.2.3 对小白鼠睾丸、附睾组织学及超微结构的检查 为了观察睾丸和附睾组织学及超微结构的动态变化，给药结束后7天，将空白组3只、造模组4只、试验组19只雄性小白鼠以颈椎脱臼法处死，将睾丸和附睾组织进行组织学及超微结构观察。给药结束后37天，在采集精液后，将各组剩余雄性小白鼠用颈椎脱臼法处死，进行第二次睾丸、附睾组织学及超微结构观察。

1.2.4 急性毒性试验急性毒性试验选择最大耐受量试验。用小白鼠40只，随机分为生理盐水组与用药组，每组20只，雌雄各半。用药浓度为50%，给药体积为 0.4ml/10g，间隔4小时分两次灌喂给药。总给药量按所含生药计算为20.0g/kg,观察小白鼠用药后反应及死亡情况，连续观察1周。

1.3统计学处理 小白鼠合笼试验结果、精液指标以及急性毒性试验结果用Instat统计软件(GraphPad Software,California USA)进行处理。

2结果

在造模过程中，试验组1只小白鼠因丝线脱落，掉入水中被溺死。因此，试验组雄性小白鼠剩37只。

2.1对小白鼠生育功能的影响

小白鼠合笼试验结果如表1所示。

表1 小白鼠合笼试验结果

组别

小鼠笼数（雌雄）

产仔数

平均每笼产仔数

空白组

7

52

7.43+4.86

造模组

8

7

0.88+2.10

试验组

37

209

5.15+5.53

经单因素方差分析，p=0.0412，组间具有显著性差异。组间两两比较，空白组与模型组（p=0.014）以及模型组与试验组（p=0.018）具有显著性差异，空白组与试验组（p=0.391）无显著性差异。

2.2对小白鼠精液指标、睾丸及附睾组织学影响  经单因素方差分析，4组间小白鼠精子总数及活动精子总数均无显著差异。4组小白鼠生精小管直径、管周膜厚度、管内细胞层数及生精成熟度均无显著差异。

2.3对睾丸及附睾超微结构的影响 将空白组小白鼠睾丸组织及附睾组织超微结构作为对照，对造模组、小剂量组以及大剂量组小白鼠睾丸及附睾组织超微结构进行观察。

造模组小白鼠先后两次睾丸电镜观察可见精母细胞细胞核外形不规则，核周间隙扩张，内质网扩张，基底膜凹凸不平且厚薄不均匀，甚至基底膜消失。间质细胞核周间隙扩张更明显，细胞内可见多量空泡。

图1造模组睾丸组织超微结构 （×10000）长箭头示细胞核外形不规则，短箭头示核周间隙扩张

造模组小白鼠先后两次附睾电镜观察可见精子头增大且不规则，线粒体鞘解体，线粒体颗粒脱落，精子中断呈裸轴现象，基底膜可见大量胶原纤维。

模组小白鼠附睾组织超微结构（×10000）短箭头示裸露的精子中段，长箭头示由精子中段脱落下来的线粒体鞘

试验组小白鼠第一次睾丸组织电镜观察显示精母细胞间隙增宽，基底膜厚薄不均匀，核仁浓缩，胞浆内质网扩张。第二次睾丸组织电镜观察可见大部分精母细胞形态及分布正常，偶可见次级精母细胞内线粒体凝集变化，可见正常成熟精子。

3-1试验组小白鼠第一次睾丸组织超微  图3-2试验组小白鼠第二次睾丸组织超微

结构检查结果（×10000）                 结构检查结果（×10000）

短箭头示核仁浓缩，长箭头示胞浆内质网    箭头示成熟精子扩张

试验组小白鼠第一次附睾组织电镜观察可见精子肿胀，精子头部染色质不均匀，部分精子线粒体鞘脱落。第二次附睾组织电镜观察附睾内精子形态均正常。

图4-1 试验组小白鼠第一次附睾组织超微 图4-2试验组小白鼠第二次附睾组织超微

结构检查结果(×10000) 短箭头示脱落 结构检查结果(×10000) 箭头示正常的精子

的线粒体鞘，长箭头示裸露的精子中段

2.4急性毒性试验 在急性毒性试验中，用药后小白鼠出现倦伏，活动减少，约2小时后恢复。用药组动物活动、皮毛、大小便、饮食等均未见异常。两组动物体重在观察结束时对照组为23.65+0.88g，用药组为23.50+ 0.75g，经t检验两组间无显著性差异(p>0.05)。两组动物均无死亡。大体解剖均未见有肉眼可见的病理改变。

3 讨论

传统中医根据望闻问切的结果对患者进行辩证，然后才能对症下药。但是，在临床实践中，许多男性不育患者外表健康，只是在精液检验时才发现质量低下，属于有病无证的范畴。对这些患者，难以进行辨证施治。精子是人体内唯一能快速运动的细胞，在中医理论看来，一切与运动有关的生理机能均需要“气”来推动，而生殖功能为中医藏象中的肾所主。根据这一理论，我们以补气、益肾为治则制定了本处方，并在初步临床试用获得疗效的基础上进行动物试验来探讨其作用机理，并确定是否存在毒性。

在合笼试验中，试验组小白鼠平均每笼产仔数虽低于空白组，但显著高于造模组，说明服药明显提高了造模后小白鼠的生育能力。但是，空白组、造模组、试验组小白鼠精子总数及精子活率均无显著差异，生精小管直径、管周膜厚度、管内细胞层数及生精成熟度也无显著差异。那么，睾丸和附睾热水浴是通过什么途径导致了造模组生育能力下降?服药又是通过何种机制使造模后小白鼠生育能力改善的呢?睾丸和附睾超微结构检查发现，造模组睾丸内生精细胞细胞核、内质网以及生精小管基底膜均出现明显病理变化，附睾内精子出现头部肿胀及线粒体脱落，出现了独特的“裸轴”现象。在试验组，睾丸及附睾病理变化与造模组相比均有明显好转。而且停药后三周睾丸、附睾超微结构与停药后一周以及造模组比较均有显著改善，基本达到正常。这说明， “精之助胶囊”可有效逆转热水浴造成的睾丸、附睾超微结构变化，从睾丸、附睾超微结构方面解释了服药组小白鼠生育能力得到改善的药理机制。

虽然本实验证实“精之助胶囊”可以通过影响睾丸、附睾的超微结构提高造模后小白鼠的生育能力，但本实验的造模是采用热水浴，而导致生育功能下降的原因有很多。该制剂对其它原因所致的生精障碍是否有效，该制剂提高生育能力是否还存在其它机制，尚需进行进一步研究。

参考文献

1、 黄平治 李永海 男性不育北京 科学技术文献 出版社 1990

2、 罗和方 五子地黄汤对家兔少精症治疗的实验研究 中国医药学报 1998;13(2)：70