前列灌肠剂保留灌肠对大鼠慢性非细菌性前列腺炎组织内炎症因子TNF-α和COX-2的影响

慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)是男科常见疾病之一，大量文献资料表明，炎症因子的异常表达在慢性非细菌性前列腺炎的发病机制中起重要作用[1]。前列灌肠剂是治疗慢性前列腺炎的纯中药灌肠煎剂，我科应用该药保留灌肠治疗慢性前列腺炎效果显著。为研究该方的治疗作用，本实验就该药对大鼠慢性非细菌性前列腺炎组织内TNF-α和COX-2的影响进行研究，现将结果汇报如下：

1.材料与方法

1.1 实验动物：

健康SPF级雄性10月龄SD大鼠60只，体重440g—550g，均购自浙江中医药大学实验动物中心，动物均饲养在浙江中医学院实验动物中心，动物许可证号：SCXK(沪) 2008-0016。正常喂养，置实验室适应环境1周后进行实验。

1.2 药物与仪器：

前列灌肠液药物购自浙江中医药大学附属第二医院中药房，由浙江中医药大学附属第二医院中药制剂室制备。阿司匹林肠溶片(南京金陵制药厂，批号：030902)；生理盐水(安徽华源生物药业有限公司，批号：20080603)。溴化乙锭(EB)荧光染液(Sigma公司，美国)，Trizol（Invtrogen公司），M-MLV Reverse Tran-ase cDNA synthesis kit (Promega公司)。

9600型聚合酶链反应仪（PE公司），GelDOC2000型凝胶成像分析系统（Bio-Rad公司），JM-250电泳仪（大连捷迈科贸有限公司），DU600series紫外分光光度计（美国Beckman公司）。DT2000电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)，JA2003电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1.建立动物模型

采用魏武然大鼠非细菌性前列腺炎建模方法构建模型[2]，将SD大鼠以3.5%的水合氯醛按照1ml/100g的标准腹腔注射麻醉，在无菌条件下行去势手术，缝合皮肤，消毒包扎，放回鼠笼，自由饮食。第2d开始，以0.25mg/kg标准给与背部皮下注射苯甲酸雌二醇，连续30d。

1.3.2分组与给药

整个实验操作过程均饲养于标准的Ⅱ级动物房，适应性饲养1周后随机分为6组，每组10只。其中五组造模，一组为正常对照组。造模的五组分别为前列灌肠液高、中、低剂量组、阿司匹林组、模型对照组。

根据《中药药理学研究方法学》中的方法计算人大鼠等效剂量：大鼠剂量=人剂量×35(人因子)/6(大鼠转换因子)。根据换算系数确定大、中、小剂量组分别给予生药量1.2、0.6、0.3 g/kg体重剂量保留灌肠。阿司匹林剂量参照说明书，用生理盐水溶解稀释成30mg/kg混悬液。模型对照组和正常对照组均以生理盐水保留灌肠。以上各组灌肠液均为2ml，液体温度为30℃左右。各组SD大鼠于造模后第31天保留灌肠给药，灌肠前禁食不禁水12小时，直肠给药后悬尾倒立1min，每日1次，连续30天。实验结束后用3.5%水合氯醛麻醉后在无菌条件下解剖，切开腹腔，剪开耻骨联合，取出前列腺组织备用。

1.4 标本检测及结果判定

1.4.1 石蜡切片HE染色

将各组大鼠前列腺组织取出后，10%福尔马林溶液固定 24 h，常规石蜡包埋切片，并用苏木精—伊红（HE）染色，光镜下观察大鼠的前列腺组织中腺体，导管和间质的变化。

1.4.2 COX-2、TNF-α引物的设计、合成

利用NCBI基因数据库中已报道的大鼠COX-2、TNF-α和内参β-actincDNA序列，采用Oligo6.71引物分析软件进行设计，然后由上海生物工程有限公司负责合成。COX-2上游引物序列：5’GATTGACAGCCCACCAACTT3’，下游引物序列：5’CTCTCCACCGATGACCTGAT3’，扩增产物长度为412bp。TNF-α上游引物序列：5’TGCCTCAGCCTCTTCTCATT3’，下游引物序列：5’TGGTATGAAGTGGCAAATCG3’，扩增产物长度为404bp。β-actin上游引物序列：5’AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG3’，下游引物序列：5’TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT3’，扩增产物长度为240bp。

1.4.3前列腺组织COX-2、TNF-αmRNA的表达测定

采用Trizol法提取大鼠前列腺组织总RNA，方法按试剂盒说明书操作，紫外分光光度计测定RNA纯度。取一定量(含2μg)的总RNA，以寡核苷酸dT为引物，在逆转录酶的作用下合成cDNA。逆转录反应体系：模板RNA 5μl，10倍逆转录Buffer2μl，dNTP2μl，AMV逆转录酶1μl(10U)，RNasin1μl(50U)，Oligo(dT)1μl，ddH2O 6μl；反应条件为：37℃反应1h，95℃静置10min。然后以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：cDNA模板9μl(取上述逆转录反应体系的一半)，10倍PCR Buffer5μl，25mmol·L-1MgCl2 3μl，TaqDNA聚合酶1μl(2.5U)，cDNA的上游引物和下游引物各1μl，ddH2O 20μl；反应条件为：94℃5min(预变性),94℃1min(变性)，50℃1min(退火)， 72℃1min (延伸)，共循环35次，最后72℃延伸5min。取10ul的PCR扩增产物，在80V电压条件下，进行电泳分析，溴化乙锭染色后，其产物利用凝胶成像分析系统分别进行扫描分析，结果以大鼠前列腺组织中COX-2、TNF-α基因区带的灰度值与内参β-actin区带的灰度值比值表示各目的基因的表达水平。

1.5 统计学方法

数据采用SPSS10.0统计分析软件进行处理，计量资料采用（—X±s）表示，完全随机设计数据的多个样本均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，LSD法，p