支原体感染诊断的方法主要有：

（一）培养与生化反应 支原体兼性厌氧，在5％～10％CO2、80％～90％湿度的条件下，生长较好，支原体细胞中的主要成分胆固醇及蛋白质均来自培养基，后者需含血清、卵黄等。菌落形似煎荷包蛋，一般为大菌落，100～300nm，生长需7～14d，另一种，菌落10～25nm，生长快，只需24～48h，称为T株，即脲解支原体。

（二）抗体及抗原检测 肺炎支原体感染后2周，约50％产生抗体，红细胞冷凝集试验阳性，效价1∶32以上，恢复期效价4倍增长则意义大。40％～50％病例链球菌MG凝集试验阳性。另可通过补体结合试验、间接血凝、酶联吸附等检测。此外，病灶灌洗液通过PCR检测。此外，利用基因探针快速检测系统，应用同位素标记DNA，可测定肺炎支原体中的RNA，与培养相比，符合率达89％。