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不同氧浓度微环境对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响实验研究

标签:胃癌 论文精选 | 作者:李宁 | 发表时间:2015-03-20 10:38:48

不同氧浓度微环境对大鼠骨髓间充质

干细胞增殖的影响实验研究﹡

李宁1 吴桂英3李启明2,廖忠莉1

1.第三军医大学新桥医院高压氧治疗中心, 重庆400037;2.第三军医大学新桥医院肿瘤研究所,重庆4000373.重庆市肿瘤研究所内科,重庆 400030

摘要: 目的 观察不同氧浓度微环境对间充质干细胞增值的影响,对比分析间充质干细胞在体外常规培养与机体生理微环境中增值情况的差异。方法 从大鼠骨髓中分离获取间充质干细胞;体外培养扩增后,以0.3×104细胞/孔密度接种于96孔培养板;待细胞完全贴壁后,按照实验分组:常规培养组、高压氧组和低压氧组进行处理;采用MTT发连续5天测定各组细胞OD值;统计分析不同氧浓度条件下骨髓间充质干细胞的增值情况。结果 常规培养组比较, 1.5 KPa高压氧组MSCs增长旺盛,第5天的OD值是常规培养组的1.2倍;且随着每次吸氧时间的延长而有增加趋势;2.0 KPa高压氧组和低压氧组MSCs表现不同程度的增值抑制,仅为常规培养组的64%26%结论 适宜的高浓度氧微环境可以促进大鼠骨髓间充质干细胞的增值。

关键词:间充质干细胞;氧浓度;微环境;增值;MTT

The effects of different oxygen concentration microenvironment on the proliferation of rat bone marrow stromal stem cells

LI-Ning1, LI Qi-ming2,WU Gui-Ying3LIAO Zhong-li1

1. Center of HBO, Xinqiao hospital, Third Military Medical University ,Chong qing 400037,China ; 2. tumor institute, Xinqiao hospital, Third Military Medical University ,Chong qing 400037,China3. Department of Internal Medicine, Chongqing Tumor Research Insitute, Chongqing 400030, China)

Abstract-ive To observe the effect of different oxygen concentration microenvironment on the proliferation of rat bone marrow stromal cells (BMSCs) and contrastive analysis the difference of proliferation between the conventional culture and the physiological microenvironment . Methods Culture the MSCs in vitro after obtained from rat bone marrow amplification. The third generation MSCs were seed in the 96 well Cell Culture Plates by 0.3×104/well density. The experiment was divided into 3 groups: the conventional culture group, the High Pressure Oxygen group and the Low Pressure Oxygen group. The OD value was measured with MTT in successive 5 days. Results MSCs proliferation of the 1.5 KPa High Pressure Oxygen group was 1.2 time higher than the conventional culture group on the fifth day; but the 2.0 KPa High Pressure Oxygen group and the Low Pressure Oxygen group was 64% and 26% lower than the the conventional group. Conclusions The eligible high oxygen concentration microenvironment culture can promote the proliferation of rat bone marrow stromal stem cells.

Key words: BMSCs, oxygen concentration, microenvironment, proliferation, MTT

干细胞是一类未分化的细胞或原始细胞,是具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定的条件下,干细胞可以分化成机体内的多功能细胞,形成任何类型的组织和器官,以实现机体内部建构和自我康复能力[1]。自从1970年小鼠胚胎干细胞在体外培养获得成功后,有关干细胞的研究越来越受到国内外学者的关注。干细胞的增值与分化一直是研究的重点,氧作为生命活动所必需环境因素,对间充质干细胞的增值、分化具有重要的调节作用[2]。本文以大鼠骨髓间充质干细胞研究对象,利用高压氧舱改变细胞培养微环境中的氧浓度,采用MTT法检测细胞增值情况,对比分析不同氧浓度对干细胞增值的影响。

1材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 DMEM/F12培养基(Hyclone公司)、胎牛血清(Euroclone公司),Percoll细胞分离液(TBD公司),四甲基偶氮唑蓝MTT、二甲基亚砜(Amresco公司),Wistar大鼠(本校动物所),OLYMPUSIX70型生物倒置显微镜(日本Olympus公司),实验专用高压氧舱(本室),HT2000plus多孔读数仪(日本Olympus公司

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分离与培养 1)原代培养:参考文献[3],选取 2月龄健康Wistar大鼠5只,颈椎脱位法处死,无菌条件下取出股骨,用内含肝素钠生理盐水(1200U/ml)的10ml注射器抽出骨髓1.01.5mlDMEM培养液稀释骨髓后,将细胞悬液缓慢加至离心管中Percoll分离液(密度为1.073g/cm3)液面,进行梯度离心(2500r/min×20min),然后缓慢吸取中间交界面呈云絮状细胞至另一离心管,用PBS冲洗2(1500r/min×5min),加入含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液以2×105/cm2的密度接种于35cm2玻璃培养瓶,48h首次换液,以后每3天换液。孵箱内培养条件:37℃、5%CO2、饱和湿度。(2)传代培养:待细胞克隆完全形成后,进行消化传代。PBS洗涤2次,加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA3ml,消化约3min,加入3ml含血清培养液,离心(1500r/min×5min)1×104/cm2的密度传代培养。传代培养细胞长满瓶底后,继续按同样方法再扩增1代。以第3代细胞为实验对象。

1.2.2 96孔板接种 将处于指数生长期传至3代的骨髓间充质干细胞用PBS冲洗2遍,加入0.25% 37oC预热的胰酶1mL,消化35min (标准为70%的细胞变圆),适量血清中和胰酶,将细胞从瓶壁上吹打下后吸入离心管,800rpm×3min后弃上清,培养基重悬并制成单细胞悬液,浓度为2×104/mL。用移液器吸150μL接种于96孔板,3000细胞/孔,置于孵箱内常规培养。

1.2.3 实验分组与不同浓度氧处理 按照实验设计分为3大组:常规培养组;高压氧治疗组,又根据气压强度(1.5KPa2.0 KPa)和吸氧时间(30min/次、60min/次)分为4组;低压氧治疗组,又根据气压强度(-1.5KPa-2.0 KPa)和吸氧时间(30min/次、60min/次)分为4组。待细胞完全贴壁后,按照实验分组将96孔培养板置于实验专用高、低压舱内进行高低压氧治疗,每天一次,共处理5天。

1.2.4 MTT法检测MSCs增殖情况 给予不同氧浓度处理后15天用MTT法连续测量每组细胞的OD值。实验方法为:,每孔加入MTT5mg/mL20μl37℃孵育4 h后终止培养;吸弃上清,每孔加入150μl DMSO(二甲基亚砜)振荡10 min 使结晶充分溶解。在HT2000plus多孔读数仪上490nm 波长处测定吸光度值(OD) 。每组测量6个复孔,计算细胞存活率(%) =[(实验组OD值-本底OD值)/ (正常对照组OD值-本底OD) ]×100%

1.3 统计处理 计量数据OD值以±S表示,应用SPSS13.0软件验证数据符合正态分布后,采用单因素方差分析及两两均数比较(F检验)对比分析不同氧浓度对大鼠骨髓间充质干细胞增值的影响,P


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李宁

主任医师 教授

重庆新桥医院

高压氧科

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