卡铂对裸鼠移植结肠管状腺癌

动物模型在高压氧微环境下的实验研究

吴桂英1，李宁2△，李启明3, 廖忠莉2，

(1.重庆市肿瘤研究所内科，重庆 400030;2.第三军医大学新桥医院高压氧治疗中心, 重庆400037;2.第三军医大学新桥医院肿瘤治疗中心，重庆400037)

摘要 目的 探讨卡铂对裸鼠移植结肠管状腺癌动物模型在高压氧微环境下的作用。方法 通过对实验裸鼠肿瘤体积、重量、5-溴脱氧尿苷标记指数及组织病理学的变化进行观察。结果 高压氧微环下卡铂使移植瘤生长明显受到抑制，提示高压氧对卡铂有增敏作用，解剖和病理学未发现组织器官有癌细胞转移。结论 高压氧微环能改善肿瘤乏氧细胞的缺氧状态，提高肿瘤乏氧细胞对化疗药物的敏感性。因此，高压氧联合化疗能提高其疗效，能降低肿瘤的复发和转移，其治疗是安全和有效的。

关键词 高压氧;结肠管状腺癌;卡铂;

The animal model of Nude mice transplanted with Colontubular adenocarcinoma treated by Carboplatin in the hyperoxic microenviroment

WU Gui-Ying1，LI-Ning2△, LI Qi-ming3, LIAO Zhong-li2

(1. Department of Internal Medicine, Chongqing Tumor Research Insitute, Chongqing 400030, China; 2. Center of HBO, Xinqiao hospital, Third Military Medical University ,Chong qing 400037,China ; 3. Center of cancer of PLA, Xinqiao hospital, Third Military Medical University ,Chong qing 400037,China)

Abstract: Purpose To evaluate the role of carboplatin to treat the nude mice model transplanted by colon tubular adenocarcinoma. Method Observe the change of the tumor volume, weight, 5 - bromo-deoxyuridine labeling index, and the phathology of nude mice. Result Under hyperoxic environment, carboplatin could inhibite the growth of grafted tumor, which indicate that hyperoxia could sensitize carboplatin. and there was no -stasis in

anatomy and phathology. Conclusion Hyperoxic microenviroment could improve the hypoxic condition of the hypoxic cell of tumor, and imcrease the sensitivity of tumor hypoxic cell to chemotherapy. Therefore, hyperoxia combine chemotherapy can improve the result of it, and decrease the -stasis and recurrence of tumor. This treatment is safe and effective.

Key words: Hyperbaric Oxygen ;colon cancer;carboplatin(CBP);

众所周之，由于肿瘤组织细胞生长快，其血管的形成和血管内皮细胞呈畸形生长，氧及营养物质不能满足肿瘤生长，使增殖期癌细胞转入静止期或变性坏死，癌细胞处于乏氧状态，研究发现乏氧的癌细胞的对放疗、化疗不敏感，这是治疗后复发及转移的主要原因。某些肿瘤在高压氧微环境下与放疗、化疗和光动力学等同步进行治疗上取得了一些实验和临床研究成果[1]。因此，我们试图通过动物实验进一步探讨在高压氧高压氧微环境下是否有促肿瘤增殖效应及能否有效地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、安全性，为临床治疗恶性肿瘤提供新的理论依据。

1. 材料与方法

1.1 实验动物：所用20只实验BALB/c-nu/nu裸鼠均由第三军医大学附属二院动物室提供，雌雄各半，鼠龄为4-6周，体重20-26±8.6g。

1.2 材料来源：肿瘤组织新鲜标本均来自我校三所附属医院在院手术患者，均经病理细胞学诊断为结肠管状腺癌;卡铂(carboplatin,CBP)(华联制药厂50mg/支，批号200805)，RPMI 1640，小牛血清(第三军医大学附属二院国家临床药理基地提供)。5-溴脱氧尿苷(Brdu，Sigma)，抗-Brdu单抗(由重庆市肿瘤研究所提供)。

1. 3方法：

l.3.1癌细胞动物异体移植步骤 首先取肉眼无坏死区的胃管状腺癌手术组织标本，在0.05%先锋5号生理盐水中漂洗 4-5次。制成约1mm3小块浸浴在含20%小牛血清中的RPMI 1640液中备用。尔后，在非麻醉状态下，于BALB/c-nu/nu裸鼠左腹股沟皮下植入1mm3之肿瘤组织。然后在消毒无菌条件下，标准饲料喂养。

1.3.2肿瘤细胞传代方法 首先取生长45天的第1代肿瘤。在含20%小牛血清的RPMI 1640液中去坏死组织并制成1mm3之小块，快速病理切片证实为胃管状腺癌后，分别植入两只裸鼠的双侧腹股沟皮下(左右各2块)。然后，取第2代生长35天之肿瘤快速病理切片，病理形态未变。按上述方法在另两只裸鼠颈部皮下分别植入4mm3和3mm3肿瘤组织。

1.3.3观察实验瘤的形成过程 首先取生长35天的第3代肿瘤组织(病理检证实为胃管状腺癌)，将肿瘤组织置于含20%小牛血清的RPMI 1640液中，剪碎后经纱布过滤，离心后去上清液。随后取离心后的细胞液，用排斥法计数肿瘤细胞数。再用含20%小牛血清的RPMI1640液稀释并配成2×106/ml细胞悬液。20只裸鼠在非麻醉状态下，分别在其颈部皮下分别注射0.5ml细胞悬液。密切观察裸鼠及肿瘤的生长情况，当肿瘤长出后开始测量其肿瘤大小，每3天测量1次，根据公式V=π/6·X3(测定3次直径的平均值)。计算肿瘤体积(V)，按照平均体积绘制生长曲线。

1.3.4 高压氧微环境曝露方法 实验曝露方法：动物实验舱采用DWC150/300型(山东烟台持久集团高压氧舱有限公司制造)，动物进舱，用纯氧洗舱10min，加压速度率为100kPa/min，加压到0.25Mpa，停留80min，停留中用纯氧通风10 min，尔后在10 min内匀速减压至常压，出舱，每日1次，共9次。将52天后将长出肿瘤的实验肿瘤裸鼠随机分成4组，见下表。

20只实验肿瘤裸鼠随机分组情况

组别 例数

(只) 压力

(Mpa) 氧浓度 HBO曝露方法 HBO曝露时机

A组 空白对照 5

B组 (HBO+H2O) 实验对照 5 0.25 纯氧 80min,1次/d×9day 53天后

C组 (CBP) 5

D组 (HBO+ CBP) 实验组 5 0.25 纯氧 80min,1次/d×9day 53天后

实验肿瘤裸鼠入舱前10分钟，B组腹腔内注射生理盐水0.5ml/只。C组与D组腹腔内注射CBP 2.5mg/kg/只。高压氧曝露完成后，让体内残留药物继续起效3天，并观察裸鼠生长情况。同时，在处死裸鼠前15小时腹腔内注射Brdll50g/kg/只，进行肿瘤体内标记;处死裸鼠后完整分离出皮下肿瘤并测量肿瘤3个不同直径，计算其体积(V)，同时称其重量(W)、测量标记指数和常规病理细胞学检查，并观察记录实验肿瘤裸鼠肝、肺、肾有无肿瘤转移灶。

1.2.4标记指数测定 标记指数的测定按胡氏[2]介绍的方法进行。被标记的S期细胞核呈均匀红染，未标记的核呈兰染，用单盲法在光镜下计数1000个细胞，记录总细胞数和被标记细胞数，标计指数(LI)按下列公式计算：LI-BrdU标记阳细胞数/总细胞数×100%。

1.2.5资料分析 用q检验对实验数据进行统计学分析。

2.结 果

2.1实验肿瘤裸鼠生长情况 第3代人胃管状腺癌裸鼠皮下移植，3周后可见皮下肿瘤。以后有一个较快的生长期。实验开始后B组(HBO组)再出现一个加速生长期，而A组(空白对照)和C组(实验对照)基本呈水平生长，D组(实验组)肿瘤体积生长曲线下降。

2.2实验肿瘤裸鼠生长情况统计学分析 各级之间肿瘤的体积和重量经统计学处理，除A组与C组之间无统计学意义(提示单用CBP无明显效果)外，其它各组之间均有统计学意义。A组与B组比较，肿瘤体积(V)和重量(W)(P