高压氧与肿瘤乏氧细胞的研究进展

李宁，李启明

(第三军医大学新桥医院，重庆 400037)

肿瘤乏氧细胞及其放化治疗抗拒性的问题一直是肿瘤学家和放射生物学家研究的重点之一。近年来对乏氧细胞的形成机制以及对肿瘤治疗的影响进行了更深入的研究,随着高压氧医学的不断发展, 及其治疗在肿瘤放化治疗中的引入,并在临床治疗中

1.对肿瘤乏氧细胞形成机制

1.1慢性乏氧:即远离血管的肿瘤细胞因超过了氧的有效弥散距离(100～150μm) 而处于乏氧状态,这种由于超过了功能性血管有效供氧范围而引起的乏氧称为慢性乏氧。

1.2 急性乏氧:由于肿瘤血管网结构和功能异常或肿瘤组织间液压升高使血管内血流暂时减少或阻滞,也会导致血管周围细胞缺氧。这种由血管原因所致的短暂血流中断、血管周围细胞乏氧称为急性乏氧[1 ] 。过去认为这两种形式的乏氧对细胞影响是相似的,但现在已有研究显示急性乏氧(而不是慢性乏氧) 可增加肿瘤转移机会。Cairns 等[2 ]将种植了KHT2C(鼠纤维肉瘤) 的荷瘤小鼠分成3 组研究肺部转移灶:一组每天持续吸入2 h 5 %～7 %的氧(慢性乏氧) ,另一组每天间歇吸入12 次、10 min 的5 %～7 %氧(急性乏氧) ,对照组吸入正常空气。其结果发现急性乏氧组比对照组的肺转移灶显著增多,而慢性乏氧组与对照组差别无显著性意义,故认为急性乏氧可能会增加肿瘤转移的机会。它们提示这两种形式的乏氧有不同的生物效应,值得深入研究。

2. 肿瘤乏氧细胞生物学特性

2.1乏氧与肿瘤恶性表型:过去认为乏氧细胞大多增殖变缓,如果氧合状态好转则增殖恢复,若持续乏氧则细胞最终坏死。但近年来人们发现肿瘤乏氧细胞并非静止的、无所作为的,而会为适应乏氧而发生一系列生物学改变,从而促进肿瘤的恶性表现[3 ] 。Semenza[4 ]认为除了血红蛋白能感受氧分压的变化外,所有的哺乳动物类细胞都有一些替代机制来感应氧浓度的变化,并以活性氧分子作为信使和(或) 激活乏氧信号传导通路来传递信号。乏氧信号传导通路与生长因子激酶通路有交叉重复,还可包括氧合作用的信号通路。而其中最重要的分子是乏氧诱导因子(hypoxia2inducible factor ,HIF) ,它是一个属于bHLH2PAS 蛋白族的转录因子,由HIF21α和HIF21β两个亚单位组成[5 ] 。HIF21α在正常氧合细胞内很快被降解,但在乏氧时稳定性增加,从而可上调30 余种基因的表达( 如EPO、NOS2、Flt21、GLUT21、GLUT23、PK2M、IGF22__等) ,从而改变肿瘤细胞的生物特性。例如:HIF21α可以上调c2Met 蛋白表达水平,c2Met 与周围间质细胞分泌的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor ,HGF) 结合可增强细胞的运动、侵袭和转移的能力[3 ] 。HIF21α还可上调碳酸酐酶(car2bonic anhydrase IX,CA9) 、血小板衍生生长因子(PDGF) 和血管内皮生长因子(VEGF) 的表达水平,从而促进肿瘤的血管生成。另外,有些研究结果显示乏氧微环境一方面诱导细胞p53 蛋白表达增加,促进细胞的凋亡;另一方面又通过诱导基因点突变、缺失、DNA 链断裂和增加基因组的不稳定性等机制使一些原癌基因激活、扩增或抑癌基因失活,如抑癌基因p53 缺失、凋亡抑制蛋白bcl22 过表达,从而使细胞丧失凋亡能力[6 ,7 ] 。此外,还对细胞施加选择压力,诱导细胞产生对乏氧环境的耐受,使有生长优势的、恶性程度更高的细胞优先生长。也就是说,经过“乏氧”而幸存的细胞将具有更高的生长、侵袭和转移能力。Adams 等[8 ]概括了乏氧可诱导的分子事件如下:细胞恶性进展;对放化疗更为耐受;增加对热的耐受;诱导血管生成;上调信号传导水平;上调TNF 分子水平;上调野生型p53 水平;改变细胞表面黏附分子的表达水平;增强肿瘤的转移扩散;诱导细胞内还原酶的合成;诱导NO 合成酶的生成等。总之,肿瘤的乏氧微环境可以促进肿瘤血管生成、侵袭性生长和远地转移,从而增加肿瘤的恶性程度。

3.肿瘤乏氧细胞研究目前关注的问题及进展

1. 实体瘤内乏氧细胞的显像研究:肿瘤乏氧是重要的,但目前还没有可用于临床的完善的检测方法[9 ] 。对放射治疗来说,最需要的是能够直观、立体地显示并定量乏氧细胞范围的显像技术,这样的“生物显像”才有可能结合三维适形和调强技术进行BC 放疗[10 ] 。已经发展的非损伤性乏氧细胞检测技术中以核医学示踪技术、磁共振显像及波谱学的研究为主要研究重点。

(1) 核医学方面主要是以乏氧细胞标志物为放射显像示踪剂,已经开发和研究的主要有硝基咪唑类和生物还原性化合物。硝基咪唑类示踪剂的主要作用机制是[11 ] :硝基基团在组织内经酶作用形成一种活性阴离子,当氧分压正常时,该离子很快被再氧合;但在低氧分压的肿瘤乏氧细胞中,该种离子不能再氧合反而会产生更多的还原物,并与细胞内大分子物质结合从而滞留在乏氧组织内。随着时间推移,结合物会逐渐从乏氧组织内被清除。因此,使用核素标记的硝基咪唑类化合物可以显示肿瘤乏氧区域,显像剂与乏氧细胞的结合率与组织氧浓度、药物浓度、药物与乏氧细胞接触时间、药物结构有关,还受组织中硝基还原酶活性影响。该类示踪剂主要代表药物有: ①卤素标记的硝基咪唑,以FMISO 为代表。18F2FMISO 被用作肿瘤乏氧PET显像的研究很多,从晚期头颈肿瘤、肺癌、前列腺癌、鼻咽癌和胶质瘤等所得到的研究数据都证实了该技术有一定可行性[12 ] 。如Rasey 等[13 ]曾对37 例癌症患者在治疗前进行了18 F2FMISO2PET 扫描,结果36例显示存在乏氧,但因为没有完全的随访,所以对FMISO 检测的乏氧与临床结果之间的相关性未能进行评估。FMISO存在的主要问题是[11 ] : 乏氧选择性不太高, 半衰期过短(1.85 h) ,成像效果不理想。目前正在研究一些半衰期较长的FMISO 替代化合物。另外,用18 F2EF1 可直接比较PET 成像和EF5 在肿瘤活检标本中的检测结果,动物实验研究证实PET显像的乏氧区与免疫组化法测定的一致[12 ] 。②含碘化糖的硝基咪唑衍生物,有IAZR、IAZA、IAZP 等。其中IAZP 有较低的分配系数并能很快从血中被清除,其脱碘作用是同族化合物中最低的。虽然该族化合物适用于SPECT,但其新成员FIAP 既有IAZP 中高能的I2C 键,又表现较低的甲状腺亲和性,被认为是18F 标记的PET化合物和123 I 标记的单光子试剂的交叉点。③99mTc 标记硝基咪唑,主要是锝PnAO 衍生物,代表化合物是BMS181321 和BRU59221[11 ] 。BMS181321 在体外表现出对乏氧肿瘤细胞的高度选择性,给药2 h 后乏氧细胞是正常细胞的9 倍;但在肝脏的摄取量高,故不适用于临床。BRU59221 比前者的稳定性提高,虽然绝对摄取量有所下降,但得到的乏氧与正常细胞的差别也和它差不多。此外还有由99mTc 标记的一种硝基三唑衍生的放射增敏剂———AK2123 ,其动物实验数据与IAZGP 的相当。生物还原性示踪剂的显像机制是被肿瘤乏氧细胞还原而选择性蓄积在乏氧组织。该类主要有: ①氨硫脲类:用60Cu、62Cu 、64Cu 与氨硫脲类化合物(如PTSM、ATSM) 结合形成放射性示踪剂发现,Cu2ATSM比18F2FMISO 具有较高的细胞摄取量和更快的从正常氧合组织清除的速率,而铜核素的半衰期也较长(如64Cu 为12. 9 h) 。Cu2ATSM的这些特点可以提供更高质量的PET 图像,是一种较有希望的显像剂[14 ,15 ] 。②锝BnAO(HL91) ,它在所有锝试剂中显示出最好的肿瘤聚集和肿瘤与背景的比值,是一种有潜力的药物[14 ,16 ] 。将以上各种放射示踪剂结合SPECT或PET技术就可得到乏氧区图像,但放射生物学家为了能在治疗计划中绘出那些需要额外剂量的、有放射抗拒性的乏氧细胞区域,所需要的空间分辨率至少为0.5 cm。目前,只有PET能够提供这样分辨率的断层扫描图像[14 ] 。正如前所述,目前PET乏氧显像所用的18F 的半衰期短,故开发半衰期较长的PET放射性核素是乏氧显像研究努力的方向。(2) 磁共振显像及波谱学方面的研究主要有: ①功能性核磁共振显像,可同时记录形态学上和功能上的图像的功能性MRI 已经应用于对肿瘤的乏氧显像。如梯度回声磁共振成像(gradient recalled echo magnetic resonance imaging , GRE2MRI) 是一种实时动态监测肿瘤病人吸入不同比例混合气体后,氧合水平和血流灌注变化的非损伤性检测法[17 ] 。另外,overhauser 增强磁共振成像(overhauser enhanced magnetic reso2nance imaging ,OE2MRI) 是双重共振技术,通过应用overhauser效应综合了MRI 解剖结构信息和电子顺磁性共振波谱学(EPR) 敏感度的长处[18 ] 。动物实验显示该方法有定量PO2的能力,还可监测吸入不同氧浓度时肿瘤氧合的变化。但是它存在着射频能量沉积的热效应问题,还不适用于人体,尚需要通过物理和化学方面的改进实现临床目的。②核磁波__谱学MRS 主要包括a. 31P2MRS ,通过测定含31P 分子(磷酸肌酸、ATP、ADP、AMP、phosphomonoesters、inorganic phosphate 等)的相对比例来间接评估肿瘤氧合水平,缺点是不能对乏氧定量; b. 1H2MRS , 糖无氧酵解的内源产物—乳酸盐, 可通过MRS 检测作为缺血和乏氧的指示剂;这种测量方法复杂,信号干扰是其最主要问题,31P 和1H2MRS 技术在临床上可用来观察各种治疗对肿瘤病人所产生的效应[19 ] ; c.19 F2MRS ,以MRS 技术检测肿瘤与19F 标记的乏氧标志物(CCI2103F、EF1、EF5 等) 结合的情况,也可反映肿瘤乏氧程度。虽然利用乏氧细胞标志物进行实体瘤内乏氧细胞显像研究已经做了不少工作,也取得了一些进展,但目前该技术仍不够成熟。存在的主要问题是如何正确选择肿瘤乏氧显像的合适时机,以及如何界定肿瘤灌注显像与真正乏氧细胞之间的区别。另外,目前仍缺乏这些研究指标与经典指标和方法的比较研究。

2. 克服肿瘤乏氧的研究

(1) 乏氧细胞增敏剂的开发和研制:乏氧细胞放射增敏剂被认为是最有希望的解决乏氧细胞放射线抗拒问题的方法[1 ] 。这方面的研究已进行了多年,其代表药物是有高电子亲和力的硝基咪唑类化合物,如52硝基咪唑(甲硝唑、尼莫唑) 和22硝基咪唑(米索硝唑、依它硝唑) 。它们能模拟氧的放射增敏作用并选择性地与乏氧细胞结合,而且因为在肿瘤内弥散的过程中不参加正常细胞的代谢,所以不会像氧一样受血管弥散的限制,从而可以最大限度地使乏氧细胞增敏。动物实验表明硝基咪唑类药物的增敏比可达到2. 0～2. 5 ,接近于氧的增敏程度;但其神经毒性限制了临床不能应用有效的药物浓度,为此需要开发研究毒性较低而更有效的乏氧细胞增敏剂。近年来出现了一些新型的乏氧细胞增敏剂,它们通过不同作用机制,如改善组织氧合状态或选择性杀死乏氧细胞从而达到增敏作用,主要有以下几类:a. 乏氧细胞毒药物—TPZ (tirapazamine , SR4223) ,它是双功能化合物,既具有乏氧细胞毒作用又可增加放射线对乏氧细胞的杀伤力,有研究表明其效果优于依它硝唑[20 ] ;b. NO 供体—如Na2N2O3 等,可模拟氧的作用,诱导和稳定辐射所致毒性DNA 游离基从而达到增敏作用[21 ] ; c. 血红蛋白别构效应物—RSR13 ,能稳定处于脱氧状态的Hb 使Hb2O2 亲和力下降,提高肿瘤微环境中氧水平[22 ] ;这些化合物正进行临床前或早期临床研究。

(2) 其他方法:早期人们曾用高压氧来提高放疗的疗效,但该方法不能改善急性乏氧,吸入高压氧甚至可能引起呼吸抑制反而使肿瘤的血供更差[23 ] 。后来的研究多采用95 %氧加5 %二氧化碳的混合气体carbogen (卡波金) ,二氧化碳的加入可防止呼吸抑制,但这种方法仍然只能改善慢性乏氧。

目前正在进行临床Ⅲ期试验的联合卡波金烟酰胺的加速放疗( accelerated radiotherapy combined with carbogen and nicoti2namide , ARCON) 方案,将卡波金与烟酰胺联用以同时改善急慢性乏氧,该法疗效还在评估中。此外,有研究表明氟碳乳剂可溶解并携带大量氧通过暂时对红细胞关闭的血管,是一种能同时克服急性和慢性乏氧的药物。这些方法和药物还在临床试验中[1 ] 。

三、肿瘤乏氧研究与临床放射治疗策略

1. 多维适形放疗(multidimensional conformal radiotherapy ,MD2CRT) :乏氧是肿瘤异质性的表现之一,而肿瘤乏氧细胞又对放射线抗拒。因此人们在三维适形调强治疗这一物理适形的基础上提出BC 的概念,即在放疗计划设计中除GTV、CTV、PTV 之外还要绘出BTV —生物靶体积。通过生物显像(例如PET218FMISO 研究的乏氧细胞区) 技术可推导出BTV ,然后通过调强放疗( IMRT) 将额外的高剂量定位于该乏氧区,从而达到克服乏氧细胞放疗抗拒性的治疗目的。这种物理适形和生物适形相结合的技术称为多维适形放疗(MD2CRT) [10 ] ,科学家在这一方面正在进行着许多尝试。Alber等[24 ]以舌底肿瘤为例,在设定的最大剂量增强因子下通过分段的线性标准函数,将FMISO2PET显像信息转变成剂量效率分布图,结果IMRT 显示出很好的剂量适形效果。Chao等[25 ]以人头颈肿瘤的塑料模型演示了将60Cu2ATSM2PET 和相应的CT图像融合信息应用于IMRT 计划的可行性。虽然还没有临床应用的报道,但相信多维适形放疗在将来有可能提高肿瘤放疗的疗效。Brahme[26 ] 还提出BIO2ART 的方法,即以三维体内生物优化的预测性分析为基础的放疗(biologi2callly optimized 3D in vivo predictive assay2-d radiation thera2py) 。他主张在放疗前和放疗1. 5 周左右进行2 次PET2CT扫描,通过PET2CT图像融合技术,可得到精确的肿瘤轮廓以及肿瘤治疗反应的数据,从而可修订治疗计划和对治疗效果进行动态监测。虽然,Brahme 只提到利用内在的8B ,11C,13N ,15O并结合FDG来获取肿瘤细胞密度、血管和血流灌注等信息,但他也指出乏氧显像对放射不敏感肿瘤的重要性。

2. 乏氧细胞毒药物的临床应用:乏氧细胞毒药物目前尚未能真正在临床上应用,大多数药物都处于临床研究阶段。其中以TPZ的应用希望比较大,它在体内外联合放疗或顺铂化疗的研究中都显示出对乏氧细胞有很强的选择性毒性,而对正常组织毒性低,已经进入临床Ⅲ期实验[1 ,27 ] 。还有人试图用肼苯哒嗪联合TPZ,以扩血管“偷血”的机制(a vascular‘steal’mechanism) 加重肿瘤的乏氧,从而提高TPZ 对乏氧细胞的杀伤作用[8 ] 。另一个有希望的药物是AQ4N ,它在乏氧细胞内被还原形成一种稳定的产物—AQ4 ,AQ4 能插入DNA和阻断拓扑异构酶Ⅱ的作用。在动物实验中,当AQ4N 联合一些提高乏氧程度的方法(物理阻滞或肼苯达嗪) 或放疗和一些抗癌药物时,可显示出有抗肿瘤作用。AQ4N 联合放疗治疗食管癌已进入Ⅰ期临床试验[27 ] 。有临床应用潜能的药物还有泊非霉素,它联合放疗治疗头颈鳞癌已进入Ⅲ期临床实验,显示出一定的乏氧毒性。另外,苯醌类药物—E09 在离体细胞实验中显示对乏氧细胞的毒性是有氧细胞的30倍,但其用于非小细胞肺癌治疗的Ⅰ、Ⅱ期临床试验却没有得到明显的抗癌效果。这些试验疗效不显著的原因可能是单独应用乏氧细胞毒药物的结果,如果能象TPZ、AQ4N 那样联合放化疗等其他对抗有氧细胞的疗法,E09 也可能取得好的疗效[27 ] 。

3. 其他: Patterson 等[28 ]将编码有细胞色素P450还原酶受体基因的乏氧调节表达的载体(HRE2P450R) 转染入HT1080细胞系,结果使乏氧细胞毒药物RSU1069 的毒性显著提高,而且与转染的酶的活性呈函数关系。该方法被称为基因导向酶前体药物治疗( gene2directed enzyme prodrug therapy ,GDEPT) ,若能与放化疗及乏氧细胞毒药物相结合,可能会有很好的临床应用前景。利用乏氧所诱导的基因变化作为肿瘤基因治疗的靶点,也将是未来研究的热点。例如Dai 等[29 ]的离体研究显示用反义核苷酸技术抑制HIF21α,可对胶质母细胞瘤造成非氧依赖的细胞毒作用和非p53 依赖的凋亡,并增强顺铂、鬼臼毒甙和长春新碱的作用。另外乏氧所诱导的一些基因表达,如VEGF 等,还可作为抗肿瘤血管生成治疗的靶点。

综上所述,肿瘤乏氧研究所取得的进展,已经相应地影响了治疗模式和治疗策略。利用乏氧显像可能为今后进行多维适形放疗奠定基础,乏氧相关的基因治疗也具有诱人的前景。相信随着对肿瘤乏氧研究的深入和相关检测、治疗技术的发展,因肿瘤乏氧而导致的放射线抗拒问题将会得到一定程度的解决。

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