咖啡因在骨肉瘤细胞株顺铂化疗中增效作用的实验研究及临床应用

崔秋，李鼎锋，尉承泽，王磊，范海涛

[摘要] 目的 探讨咖啡因在骨肉瘤细胞株(OS-U2)顺铂化疗中的增效作用和临床应用效果。方法 骨肉瘤细胞株经不同浓度顺铂单药0.2ug/l，2ug/l，5ug/l，10ug/l，20ug/l作用及经分别添加0.2 mmol/L，2.0mmol/L咖啡因作用24，48，72小时，通过MTT法体外细胞毒性实验观察各组中OS-U2细胞增殖情况;应用流式细胞术分析各组中OS-U2的凋亡;在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态并记录其阳性率对。23例IIB期原发骨肉瘤患者，采用动脉介入化疗系统，以顺铂 (CDDP)100～120mg/m2 为主，联合安纳加(咖啡因)1～1.5g/m2治疗。结果 在添加0.2 mmol/L，2.0mmol/L咖啡因的各浓度顺铂组中，骨肉瘤细胞的增殖能被明显抑制，其凋亡水平明显升高也。咖啡因对顺铂杀伤骨肉瘤细胞株(OS- U2)的这种增效作用存在量效及时效关系。临床治疗患者骨痛RR 97%，骨病变影像改变RR71%，病理中重度以上化疗反应占86%，平均随访30个月，生存率85%。结论：咖啡因在骨肉瘤细胞株顺铂化疗中有显著的量效及时效作用，其机制是咖啡因能加强诱导骨肉瘤细胞凋亡，从而增强顺铂对骨肉瘤细胞株的杀伤作用。临床应用本疗法对恶性骨肿瘤临床、影像、病理疗效良好;CF有明显增强CDDP抗肿瘤作用。

[主题词]　细胞凋亡，顺铂，咖啡因，骨肉瘤

[科研资助]项目名称：CDDP与CF联合治疗骨与软组织恶性肿瘤的临床研究。项目编号：2003-3029

骨肉瘤是好发于青少年，新辅助化疗已开展多年，骨肉瘤的5年生存率提高到60%～80%，对已发生患肢病理性骨折、肺转移等肿瘤患者疗效仍欠佳，多归因于肿瘤化疗过程中产生不同机制耐药性。近年随着研究的进一步深入，发现咖啡因有着潜在的逆转化疗耐药的作用。国内、外对咖啡因在多种肿瘤的增效作用进行过一系列令人鼓舞的研究。本研究的目的是进一步阐述咖啡因是否具有促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用，为临床应用咖啡因治疗骨肉瘤提供理论依据。

1　材料和方法

1.1　材料

人骨肉瘤OS-U2细胞株购于中科院上海细胞生物研究所， 咖啡因为上海信宜产品;顺铂为澳大利亚产品;细胞凋亡检测试剂盒购于北京宝赛生物技术有限公司;DMEM 培养基为美国GIBCO公司产品;胎牛血清为北京天象鑫隆公司产品;MTT为西安宝信生物有限公司产品;流式细胞仪为 FACSort， 美国Becton Dickinson公司产品。

1.2　方法

1.2.1　细胞培养　用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液，在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规培养，隔日换液，用含0.125%胰酶和0.02%EDTA消化液隔天消化、传代。

1.2.2 实验分组 OS-U2细胞株与浓度分别为0.2ug/l，2ug/l，5ug/l，10ug/l，20ug/l的顺铂作用以及与混合了0.2 mmol/L ，2.0mmol/L咖啡因的各浓度顺铂作。在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中常规培养72小时。

1.2.2　MTT法检测咖啡因对人骨肉瘤OS-U2细胞增殖的影响　收集对数期生长状态良好的细胞，用含10%胎牛血清的DMEM调整细胞数至 5×105/mL，并以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板。细胞贴壁后，各孔添加不同浓度顺铂，至终浓度分别为为0.2ug/l，2ug /l，5ug/l，10ug/l，20ug /l。 为检测不同浓度咖啡因对顺铂的作用，实验中在不同浓度顺铂中分别加入浓度为0.2mM，2.0mM的咖啡因组，以未加入咖啡因组作为对照。实验中，每孔均设平行3孔。各孔以含10%胎牛血清的DMEM补足，使得各孔终体积为200ul。将细胞置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，分别培养 24，48，72小时。培养中止前4小时，加入无菌MTT。培养结束后，使用酶联检测仪测得各组OD值。

1.2.3　流式细胞仪检测对骨肉瘤细胞凋亡的影响(annexinV/PI 双染色)。

为进一步阐明咖啡因对顺铂杀伤骨肉瘤细胞的作用，我们进行了骨肉瘤细胞在不同浓度顺铂与咖啡因作用下凋亡情况的检测。收集对数期生长状态良好的细胞，

用含10%胎牛血清的DMEM调整细胞数至1×106/mL，并以1×106细胞/孔的密度接种于24孔板。实验分组同上。分别培养24，48，72小时，收集各组细胞，按照凋亡试剂盒的说明进行染色。并用流式细胞仪进行检测。

1.2.4 骨肉瘤细胞凋亡情况荧光显微镜下观察

随后我们将经凋亡试剂盒染色后的各组细胞在甩片机上进行离心，并在荧光显微镜下观察结果。

1.2.5 统计学分析 实验数据用统计图表示，组间比较采用t检验。

1.3.1临床对象 2005年1月～2007年7月骨肉瘤化疗3次以上共23例。男性20例，女性13例，年龄8～25岁，平均年龄19岁。其中股骨上段5例，股骨下段7例，胫骨上段10例，胫骨下段1例。

1.3.2临床方法 经临床及影像学诊断后，积极完善术前准备，行埋置化疗装置[1]。可选用股动脉或肱动脉。化疗泵动脉给顺铂(CDDP)100～120mg/m2 ，静脉常规水化、利尿、止吐、保肝。输完顺铂2h后用5%葡萄糖或生理盐水1000ml+安纳加(咖啡因 CF)1～1.5g/m2/24h，，经化疗泵维持72h，部分病例辅用阿霉素(ADM)。

2.结果：

2.1通过MTT结果，我们发现，相同的顺铂、咖啡因浓度下，作用时间越长，细胞增殖能力越差。在同一时间下，剂量越高，细胞增殖能力越差。而在同一时间点，同一浓度下，加入咖啡因组对骨肉瘤细胞增殖能力的抑制作用更强。初步提示，高浓度顺铂对于骨肉瘤细胞OS-U2具有强的杀伤作用，而且添加咖啡因将会增强这一作用，这一作用随着时间的延长而增强。(图1 A、B、C，不同时间，不同浓度顺铂与不同浓度咖啡因作用下，骨肉瘤细胞增殖情况)

图中A：0.2ug/l，B：2ug/l，C：5ug/l，D：10ug/l，E: 20ug/l

2.2 通过annexin V/PI 双染色，流式细胞术检测的方法，我们进一步检测了不同时间，不同浓度顺铂及咖啡因等条件作用下，骨肉瘤细胞凋亡水平的变化。结果发现，与MTT结果相似，在相同浓度顺铂及咖啡因的作用下，时间越长，骨肉瘤细胞的凋亡比例越大(结果未示出)。而在相同的时间，同一浓度顺铂作用下，加入浓度为咖啡因较咖啡因更容易诱导凋亡， 咖啡因浓度越高，骨肉瘤的凋亡比例越高。(图2 A， B)

10 ug/l顺铂 10 ug/l顺铂+0.2ng/ml 10 ug/l 顺铂+2ng/ml

A. 72 h 10ug/l顺铂单用与混合浓度0.2ng/ml、2.0ng/ml咖啡因作用下OS-U2细胞凋亡水平变化散点图。

B. 72 h 10ug/l顺铂单用与混合浓度0.2ng/ml、2.0ng/ml咖啡因作用下OS-U2细胞凋亡水平变化统计图。

与单用10 ug/l顺铂组相比较，P